SILVA, Bianca Kelly Neves Izidro da. Desenvolvimento de reação de qPCR para detecção de H. capsulatum em amostras de solo de grutas e cavernas do Município de Presidente Figueiredo. 2021. 80 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2021.
Histoplasma capsulatum é um fungo encontrado no ambiente que causa uma micose profunda, que se apresenta de forma assintomática à disseminada. Na forma disseminada acomete principalmente pacientes com AIDS. Na América do Sul, essa enfermidade é uma das três principais que levam o paciente com AIDS a óbito. Apesar destes fatos poucos estudos avaliaram sua distribuição ambiental. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de reação de qPCR para detecção de H. capsulatum em amostras de solo de grutas e cavernas do Município de Presidente Figueiredo. Inicialmente, foi feito um estudo in silico com software Geneious para desenvolver um primer da região ITS do DNAr de H. capsulatum, em seguida o conjunto de primers e sonda foi validado com a execução da curva padrão com DNA de cultura do fungo alvo, cálculo do erro experimental, teste para verificar reações cruzadas com outros patógenos e teste de sensibilidade e especificidade. Por fim, com estes primers e sonda foi feita a verificação da presença do H. capsulatum em 30 amostras de solo de 2 cavernas e 1 gruta do município de Presidente Figueiredo que tiveram seu DNA extraído por duas metodologias distintas. Como resultados, foi desenvolvido um conjunto de primers e sonda para detecção de H. capsulatum para uso em PCR em tempo real (qPCR) tendo como alvo a região ITS do DNAr. O desenho desenvolvido demonstrou in silico ser tão ou mais adequado que outras propostas que tinham como alvo esta mesma região. O conjunto demonstrou resultados satisfatórios quanto limite de detecção,10 fg/μL de amostra (20 fg/reação), curva padrão adequada (r2 0,97), baixo erro experimental, ausência de reação cruzada com outros organismos patogênicos sensibilidade e especificidade adequados. Os experimentos aplicando o novo conjunto de primers e sonda em 30 amostras de solo de grutas/cavernas do Município de Presidente Figueiredo demonstraram a presença de DNA de H. capsulatum em uma amostra. A proposta de qPCR é uma nova opção de detecção/diagnóstico que poderá ajudar no entendimento da distribuição ambiental do patógeno bem como no diagnóstico clínico em amostras biológicas. A detecção de H. capsulatum em amostra de solo de caverna do município de Presidente Figueiredo reforça a necessidade de cuidados recomendados para o turismo na região.
Histoplasma capsulatum is a fungi found in the environment that causes a deep mycosis, which presents itself in the asymptomatic form until disseminated. In its disseminated form, it mainly affects AIDS patients. In South America, this disease is one of the three main causes of death for AIDS patients. Despite these facts, few studies have evaluated its environmental distribution. This study aimed to develop a qPCR reaction to detect H. capsulatum in soil samples from caves in the county of Presidente Figueiredo. Initially, an in silico study was performed with the Geneious software to develop a primer targeting the ITS region of the DNAr of the H. capsulatum, then the primer and probe set was validated with the execution of the standard curve with target fungal culture DNA, experimental error, tested to check cross reactions with other pathogens and sensitivity and specificity test. Finally, with this primer and probe, the presence of H. capsulatum was verified in 30 soil samples from 3 caves of Presidente Figueiredo that had their DNA extracted by two different methodologies. As a result, a set of primers and probe was developed to detect H. capsulatum for use in real-time PCR (qPCR) targeting the ITS region of DNAr. The design demonstrated in silico to be equal or more appropriate than other proposals that targeted this same region. The set demonstrated satisfactory results in terms of detection limit, 10 fg/μL of sample (20 fg/reaction), adequate standard curve (r2 0.97), low experimental error, absence of cross reaction with other pathogenic organisms, adequate sensitivity and specificity. The experiments applying the new primer and probe set in 30 soil samples from caves in the Presidente Figueiredo demonstrated the presence of DNA from H. capsulatum in one sample. The qPCR proposal is a new detection and diagnosis option that can help in understanding the environmental distribution of the pathogen as well as in the clinical diagnosis in biological samples. The detection of H. capsulatum in a sample of cave soil in the municipality of Presidente Figueiredo reinforces the need for recommended care for tourism in the region.